El 31 de marzo de 1578 tiene lugar el asesinato de Escobedo. La historiografía actual sostiene que fue planeado por Antonio Pérez con la aprobación del rey, que lo consideró necesario para la monarquía. Los argumentos concretos del secretario para convencer al rey no se conocen, pero los historiadores apuntan a que sin duda debieron girar en torno a las ambiciones de don Juan de Austria y la posibilidad de que decidiera por su cuenta la invasión de Inglaterra, o se aliase con los rebeldes holandeses o que, incluso, regresara a España al mando de las tropas para destituir a Felipe II. No hay en la documentación que se conserva de la época dato o indicio solvente de alguna de estas posibilidades, sino que, en 1578, la principal preocupación de don Juan de Austria era la constante necesidad de tropas y dinero para hacer la guerra en Flandes. Al conocer la muerte de su secretario, don Juan sufre por la pérdida de su secretario y por la desconfianza del rey. Le escribe al rey, y en esa carta se evidencia que don Juan comprendió lo que había ocurrido, y que no cabía esperar refuerzos de España. Le dice que siempre ha sido leal a la corona y a Su persona.
Los escritos de don Juan de aquella época revelan su depresión.
El 17 de Setiembre empezaron las fiebres. Se fue al campo cerca de Namur, y tras una terrible agonía de dos semanas, viendo la muerte próxima, nombra gobernador a su sobrino Alejandro Farnesio. Sufre un delirio de dos días, recobra la conciencia, recibe la extremaunción y muere el 1 de Octubre de 1578 a la una de la tarde a los 32 años.
A partir de ahí empiezan a correr rumores: Que el Rey había ordenado envenenarle (Guillermo de Orange) Que había sido Alejandro Farnesio por celos (el jesuita Antonio Osorio).
Recibió después de muerto los honores que le fueron negados en vida. Su funeral fue surrealista. Todos querían honrarle: Los españoles porque era hermano de su Rey. Los alemanes porque había nacido en Alemania, y los flamencos porque era su gobernador. La caravana cruzó toda la ciudad de Namur. El funeral duró desde las diez de la mañana hasta el anochecer.
Su cuerpo se preparó, fue embalsamado, se le puso un jubón holandés con pasamanos de plata y oro, su armadura y en la cabeza una corona de tela de oro adornada con piedras preciosas en recuerdo de las coronas que nuca ciñó.
Se le dio sepultura en Namur.
A los cinco meses, por orden del rey se trasladaron sus restos a España. Su séquito era de setenta personas. Se desnudó y aromatizó el cadáver, se cortó el cuerpo en tres partes, se colocaron en un baúl forrado de terciopelo y se lleva a España a lomos de un caballo. El 21 de Mayo de 1579 llegaba así el cuerpo a la abadía de Parraces, cerca de Segovia. A partir de ahí todo cambia. En vez de un cortejo silencioso, se organiza una marcha solemne, con personajes importantes y la evidencia de un patrocinio real. Se recompone el cuerpo, se le mete en un ataúd forrado de negro y se expone para anular los rumores de que no venía entero. Lo velan toda la noche. A la mañana siguiente emprende el viaje hacia San Lorenzo el Real. Al llegar a San Lorenzo la comitiva es de cuatrocientos hombres a caballo. Se dijeron responsos y misas en cada pueblo en el que pernoctaba el cortejo. Llegaron a San Lorenzo el 24 de Mayo a las siete de la tarde. Salieron a recibirle todos los clérigos encabezados por el Vicario. Allí estaban a esperarle todos lo prohombres del reino. Incluido Don Juan de Tarsis, el correo de Su Majestad. Al día siguiente el Obispo dijo la misa pontifical y se leyó una cédula enviada por Felipe II en la que manda que se deje allí en depósito el cuerpo de su “muy amado hermano” donde están los demás cuerpos reales hasta que se le lleve a enterrar en Iglesia principal.
A los ocho meses se le rendían los honores y se le daba el tratamiento reservado a los miembros de la familia real que le había sido negado en vida.
Todo esto parece como una entronización, una admisión proclamada en el seno de la familia real.
Parece que hasta su muerte ha sido engañado. Ha sido engañado por Antonio Pérez que con Dª Ana de Mendoza princesa de Éboli, posiblemente su amante, se encargó de hacer creer al rey que era un personaje inquieto que podía querer quitarle la Corona, y eso falsificando partes de las cartas que él enviaba al rey y de las que el Rey le enviaba a él. En el tiempo que transcurre desde que muere en los Países Bajos Felipe II lo descubre a través de otro secretario del Rey, Mateo Vázquez de Leca, éste le descubre que su secretario Antonio Pérez le había engañado. El rey se arrepiente de lo mal e injustamente que ha tratado a su hermano y probablemente es por eso que organiza ese funeral. Pero Juan de Austria ya estaba muerto.