La princesa de Éboli, que pretendía ganarse el favor de Don Juan para a través de él ganarse el del rey, acaba presentándole a una pariente, Doña María de Mendoza de la que Don Juan se enamora. La princesa hace de Celestina de estos amores. Hacia 1570 nace una niña, Doña Ana de Austria, que acaba teniendo una vida complicada. Primero es entregada a los cuidados de Dª Magdalena de Ulloa y luego a los seis años es internada en el convento de Nuestra Señora de Gracia en Madrigal de las Altas Torres. Con el nombre de Ana de Jesús. Ana de Jesús tuvo un oscuro asunto con un falso rey de Portugal que le costó que el Rey la condenara aunque luego la perdonó. Acaba muriendo en el convento aunque si9n ninguna vocación religiosa. El jesuita P. Antonio Osorio dice: ”don Juan guardó a su amante la misma constante fidelidad que si hubiese sido su esposa legítima, con lo que demostró que su amor no procedía de la lascivia, sino de la más noble potencia del alma (…). Se ocultó la existencia de Doña Ana para no dar disgusto al rey”. Después añade que quiso seguir a Don Juan a Lepanto y que cuando supo que se había ido sin ella pidió un caballo, y al no conseguirlo se desmayó y se negó a comer y se vistió de luto. Según Osorio volvieron a verse seis años después
Doña María volvió a ver a Don Juan en Granada donde parece que engendró a su otro hijo Francisco. Volvieron a verse nuevamente en el 1576 cuando Don Juan volvió a Madrid, y cuando Don Juan murió, Doña María se avergonzaba de sobrevivirle. A pesar del amor que siente por ella, Don Juan no hace ademán de casarse con ella porque “a don Juan sólo puede casarle el rey, y con una princesa” como decía Doña Magdalena de Ulloa.