La oposición se organiza
Galileo parece ir de triunfo en triunfo y convence a todo el mundo. Por tanto, los partidarios de la teoría geocéntrica se convierten en enemigos encarnizados y los ataques contra él comienzan con la aparición de Sidereus Nuncius. Ellos no pueden permitirse el perder la afrenta y no quieren ver su ciencia puesta en cuestión.
Además, los métodos de Galileo, basados en la observación y la experiencia en vez de la autoridad de los partidarios de las teorías geocéntricas (que se apoyan sobre el prestigio de Aristóteles), están en oposición completa con los suyos, hasta tal punto que Galileo rechaza compararse con ellos.
Al principio, solo se tratan de escaramuzas. Pero Sagredo escribe a Galileo, recién llegado a Florencia: «El poder y la generosidad de vuestro príncipe [el duque de Toscana] permiten esperar que él sepa reconocer vuestra dedicación y vuestro mérito; pero en los mares agitados actuales, ¿quién puede evitar de ser, yo no diría hundido, pero sí al menos duramente agitado por los vientos furiosos de los celos?». 
Horky es ridiculizado por los seguidores de Galileo, que responden que estos astros sirven para una cosa: hacerle enfadar. Convertido en el hazmerreír de la universidad, Horky finalmente es recriminado por su maestro: Magini no tolera un fallo tan claro. En el mes de agosto, un tal Sizzi intenta el mismo tipo de ataque con el mismo género de argumentos, sin ningún éxito.
Una vez que las observaciones de Galileo fueron confirmadas por el Colegio Romano, los ataques cambiaron de naturaleza. Ludovico Delle Combe ataca sobre el plan religioso y se pregunta si Galileo cuenta con interpretar la Biblia para ponerla de acuerdo con sus teorías. En esta época en efecto, antes de los trabajos exegéticos del siglo XIX, un salmo (Salmo 93:1) da a entender una cosmología geocéntrica (dentro de la línea: «Tú has fijado la Tierra firme e inmóvil»)
El cardenal Belarmino, que hizo quemar a Giordano Bruno, ordena que la Inquisición realice una investigación discreta sobre Galileo a partir de junio de 1611.
La primera flecha viene de Martin Horky, discípulo del profesor Magini y enemigo de Galileo. Este asistente publica en junio de 1610, sin consultar a su maestro, un panfleto contra el Sidereus Nuncius. Exceptuando los ataques personales, su argumento principal es el siguiente :
«Los astrólogos han hecho sus horóscopos teniendo en cuenta todo aquello que se mueve en los cielos. Por lo tanto los astros mediceos no sirven para nada y, Dios no crea cosas inútiles, estos astros no pueden existir».
Los ataques se hacen más violentos 
Galileo, de retorno a Florencia, es inatacable desde el punto de vista astronómico. Sus adversarios van entonces a criticar su teoría de los cuerpos flotantes. Galileo pretende que el hielo flota porque es más ligero que el agua, mientras que los aristotélicos piensan que flota porque es de su naturaleza el flotar (Física cuantitativa y matemática de Galileo contra física cualitativa de Aristóteles). El ataque tendrá lugar durante un almuerzo en la mesa de Cosme II en el mes de septiembre de 1611.
Galileo se opone a los profesores de Pisa y en especial al mismo Delle Combe, durante lo que se denomina la «batalla de los cuerpos flotantes». Galileo sale victorioso del intercambio. Varios meses más tarde, sacará una obra en la que se presentará su teoría.
Además de estos asuntos, Galileo continúa con sus investigaciones. Su sistema de determinación de longitudes es propuesto en España por el embajador de Toscana.
En 1612, emprende una discusión con Apelles Latens Post Tábulam (seudónimo del jesuita Cristóbal Scheiner), un astrónomo alemán, sobre el tema de las manchas solares. Apelles defiende la incorruptibilidad del Sol argumentando que las manchas son en realidad conjuntos de estrellas entre el Sol y la Tierra. Galileo demuestra que las manchas están sobre la superficie misma del Sol, o tan próximas que no se puede medir su altitud. La Academia de los Linces publicará esta correspondencia el 22 de marzo de 1613 con el título de ‘Istoria e dimostrazioni intorno alle marchie solari e loro accidenti. Scheiner terminará por adherirse a la tesis galileana.
El 2 de noviembre de 1612, las querellas reaparecen. El dominico Niccolo Lorini, profesor de historia eclesiástica en Florencia, pronuncia un sermón resueltamente opuesto a la teoría de la rotación de la Tierra. Sermón sin consecuencias particulares, pero que marca los comienzos de los ataques religiosos. Los opositores utilizan el pasaje bíblico en el Libro de Josué (Josué 10:12-14) en el cual Josué detiene el movimiento del Sol y de la Luna, como arma teológica contra Galileo.
En diciembre de 1613, el profesor Benedetto Castelli, antiguo alumno de Galileo y uno de sus colegas en Pisa, es encargado por la duquesa Cristina de Lorena de probar la ortodoxia de la doctrina copernicana. Galileo vendrá en ayuda de su discípulo escribiéndole una carta el 21 de diciembre de 1613 (traducida como Galileo, diálogos y cartas selectas) sobre la relación entre ciencia y religión. La gran duquesa se tranquiliza, pero la controversia no se debilita.
Galileo mientras tanto continúa con sus trabajos. Del 12 al 15 de noviembre, recibe a Jean Tarde, a quien presenta su microscopio y sus trabajos de astronomía.
El 20 de diciembre, el padre Caccini ataca muy violentamente a Galileo en la iglesia Santa Maria Novella. El 6 de enero un copernicano, el carmelita Paolo Foscarini, publica una carta tratando positivamente la opinión de los pitagóricos y de Copérnico sobre la movilidad de la Tierra. Él percibe el sistema copernicano como una realidad física. La controversia toma una amplitud tal que el cardenal Bellarmino debe intervenir el 12 de abril. Éste escribe una carta a Foscarini donde condena sin equívocos la tesis heliocéntrica en ausencia de refutación concluyente del sistema geocéntrico.
Como reacción, Galileo escribe a Cristina de Lorena una carta extensa en la cual desarrolla admirablemente sus argumentos en favor de la ortodoxia del sistema copernicano. Esta carta es, también, muy difundida. Esta carta, escrita hacia abril de 1615, es una pieza esencial del dossier. Ahí se ven los pasajes de las escrituras que poseen problemas desde un punto de vista cosmológico.
A pesar de ello, Galileo es obligado a presentarse en Roma para defenderse contra las calumnias y sobre todo para tratar de evitar una prohibición de la doctrina copernicana. Pero le falta la prueba irrefutable de la rotación de la Tierra para apoyar sus requerimientos. Su intervención llega demasiado tarde: Lorini, por carta de denuncia, ya había avisado a Roma de la llegada de Galileo y el Santo Oficio ya había comenzado la instrucción del caso.
En 1614, conoce a Juan Bautista Baliani, físico genovés, que será su amigo y correspondiente durante largos años.
El 8 de febrero de 1616, Galileo envía su teoría de las mareas (Discorso del Flusso e Reflusso) al cardenal Orsini. Esta teoría (a la cual se le ha reprochado durante mucho tiempo de estar en contradicción con el principio de la inercia enunciado por el mismo Galileo, y que sólo puede explicar pequeños componentes del fenómeno) pretendía demostrar que el movimiento de la Tierra producía las mareas, mientras que los astrónomos jesuitas ya postulaban con acierto que las mareas eran producidas por la atracción de la Luna.