Como Soberano, después de la imposición de la Corona Imperial por mano del pontífice (1530), Carlos se sentía obligado a dedicarse completamente a la solución de los problemas que el luteranismo había creado en Europa y en Alemania en particular, con el fin de salvaguardar la unidad de la fe cristiana contra el embate de los turcos. Antes, en 1523 había cedido las islas de Malta y Gozo, así como Trípoli a la Orden de Malta.
En el mismo año 1530 convocó la Dieta de Augsburgo, en la cual se enfrentaron luteranos y católicos sobre las llamadas Confesiones de Augsburgo. Carlos confirmó el Edicto de Worms de 1521, es decir la excomunión para los luteranos, amenazando la reconstitución de la propiedad eclesiástica. Como respuesta, los luteranos, representados por las llamadas «órdenes reformadas», actuaron dando vida a la Liga de Esmalcalda (1531). Tal coalición, dotada de un ejército y de una caja común, fue llamada también la «liga de los protestantes».
Es claro que los seguidores de la doctrina de Lutero asumieron la denominación «protestantes» en cuanto ellos, reunidos en «órdenes reformadas», en el curso de la segunda Dieta de Espira de 1529, protestaron contra la decisión del Emperador de restablecer el Edicto de Worms: edicto que había sido suspendido en la precedente Dieta de Espira (1526).
Reconociendo que era necesaria una reforma y para intentar resolver el problema, el pontífice Pablo III convocó un Concilio ecuménico en la ciudad de Trento, cuyos trabajos comenzaron oficialmente el 5 de diciembre de 1545. Concilio del que ni el ni el emperador ni el papa que lo había convocado vieron la conclusión.
Tras la negativa de los protestantes a reconocer el Concilio de Trento, el emperador comenzó la guerra en el mes de junio de 1546, con un ejército armado por el pontífice, al mando de Octavio Farnesio, otro austríaco mandado por Fernando de Austria y otro de los soldados de los Países Bajos al mando del Conde de Buren. También apoyaba al Emperador, Mauricio de Sajonia que había sido hábilmente apartado de la Liga de Esmalcalda. Carlos V consiguió una contundente victoria en la batalla de Mühlberg en el 1547, poco después los príncipes alemanes se retiraron y se subordinaron al Emperador. De la dieta de Augsurgo de 1548, resultó un secreto imperial conocido como el ínterin de Augsburgo, para gobernar la Iglesia en espera de las resoluciones del Concilio. En el ínterin se respetaba la doctrina católica, pero se permitía la comunión por las dos especies y el matrimonio del clero.33
Tras la victoria imperial en la guerra de Esmalcalda (1546-1547), muchos príncipes protestantes estaban descontentos con los términos religiosos del Interim de Augsburgo, impuesto tras la derrota. En enero de 1552, liderados por Mauricio de Sajonia, muchos formaron una alianza con Enrique II de Francia en el Tratado de Chambord (1552). A cambio de apoyo financiero francés y asistencia, le prometieron a Enrique la posesión de los Tres Obispados (Metz, Verdún y Tolón) como vicario del Imperio. En la consecuente guerra de príncipes, Carlos tuvo que huir a Carintia ante el avance de Mauricio de Sajonia, mientras que Enrique capturó las fortalezas de Metz, Verdun y Tolón. Ante la guerra con Francia, su hermano Fernando, como rey de Romanos, negoció la paz con los protestantes en el tratado de Passau (1552), en el que el emperador garantizaba la libertad de culto a los protestantes.
A pesar de su victoria no logró el anhelado deseo de unificar política y socialmente el luteranismo con el catolicismo, por lo que tan sólo ocho años después, en 1555, se vio obligado a suscribir la «Paz de Augsburgo» por medio del cual se reconocía el inalienable derecho de los alemanes de adherirse a la confesión católica o al luteranismo. Dando fin, aunque sea de manera temporal (50 años), al largo conflicto surgido por la Reforma.