Isabel de Portugal, nacida el 25 de Octubre de 1503, se convirtió en reina de Castilla y Aragón y emperatriz de Alemania al casarse con su primo carnal Carlos I. La vida de esta mujer estuvo marcada desde su niñez cuando en plena infancia falleció su madre al dar a luz a su último hijo. Debido a ello, Isabel como hija mayor, pasó a ocuparse de todos sus hermanos hasta que su padre volviera a casarse con la hija mayor de Juana la Loca, Leonor de Austria, hermana de su futuro marido Carlos I.
Para celebrar sus nupcias, se solicitó una dispensa de consanguinidad y finalmente la infanta portuguesa llegará a España en 1526 para proceder a la celebración del casamiento con Carlos I de España y V de Alemania. Doña Isabel logró llegar a enamorarse verdaderamente de su esposo a pesar de que como era costumbre, su matrimonio poseía fines políticos y económicos. Al parecer, Isabel personificó el perfecto ideal de mujer fiel y amante de su marido a la vez que ejercía de buena madre. Debido a ello y a que Isabel colaboró con su marido en las labores de gobierno, Carlos I a pesar de su temprana edad a la muerte de su esposa, (rondaba los cuarenta años) no volvió a contraer un nuevo matrimonio.
En 1526 Doña Isabel quedó embarazada por primera vez siendo este un embarazo acogido con gran alegría y fervor por el pueblo que se encargará de organizar procesiones y celebraciones. Al parecer en 1527, Isabel realizó su testamento en Valladolid antes de dar a luz en previsión de los riesgos que este hecho podía ocasionar. En el momento del parto, que llegó el 21 de mayo de ese mismo año Isabel tuvo su rostro tapado al igual que Isabel la Católica, aguantando los dolores propios con gran compostura, según narran algunos cronistas. Finalmente, dio a luz a su primogénito, el príncipe Felipe. Paralelamente y de forma singular en 1528 el padre Flórez estableció en una de sus obras el nacimiento de tres nuevos hijos: Juan, Fernando y María, por lo que podríamos estar ante un parto múltiple pero que parece no ser verídico ya que no llegaría a constatarse.
Un siguiente nacimiento que sí quedó registrado fue el de la infanta María, cuyo alumbramiento trajo para Doña Isabel unas tercianas (fiebre que se repite cada tres días) que complicarán su estado de salud y le producirán un futuro aborto. Aún así Isabel dará a luz en una fecha incierta a su tercer hijo, Fernando, el cual morirá a los pocos meses de edad. Antes de su siguiente parto, el de la infanta Juana en 1535, Isabel volverá a enfermar de tercianas o paludismo. Un posterior alumbramiento en 1537 traerá a la vida al infante Juan, el cual morirá a los cinco meses de edad sin que su padre pudiera llegar a conocerle.
Finalmente, un nuevo parto malogrado coincidiría aproximadamente con la fecha de la muerte de Isabel el 1 de mayo de 1539 con treinta y seis años de edad. A pesar de las numerosas hipótesis de los cronistas de la época sobre su enfermedad, hoy en día queda más o menos claro que pudo morir de una infección puerperal, la cual era muy común en esos tiempos. Doña Isabel por tanto tendrá un reinado corto y ejercerá dentro de él el típico perfil de reina como esposa y madre de los hijos de su rey.