En su primer matrimonio Felipe II tuvo como esposa su prima hermana María Manuela de Portugal nacida el 15 de Octubre de 1527. Sus esponsales se celebraron por poderes cuando ambos tenían dieciséis años tras la dispensa papal y el 15 de diciembre de 1543 María llegó a España. En torno a esto, se dice que el príncipe, impaciente por ver a su esposa, presenció la entrada oficial de su futura mujer con disfraz y de incógnito. Felipe, a pesar de casarse por designios exclusivamente políticos, no dejaba de preocuparse por el aspecto físico de su esposa, a la que consideraba algo entrada en carnes, desde el momento en que la vio por primera vez. Por otro lado, en algunos escritos se puede ver como su padre, Carlos V, le alentaba para que no se excediese en los “abusos conyugales” incluso daba instrucciones al Juan de Zúñiga para que intercediese en este aspecto.
En la tarea del matrimonio Doña María Manuela había recibido instrucciones de su madre sobre su futuro comportamiento como esposa y sobre el doloroso sentimiento de los celos que ya habían acechado a su abuela Juana la Loca. Por otro lado, como María Manuela no quedaba embarazada debido a su corta edad, parece ser que se recurrió a extraños métodos para acelerar el proceso de maternidad. Sin embargo, a principios de 1544 la princesa quedaría embarazada y un año después daría a luz a su primogénito Carlos, cuyo nombre fue otorgado en honor a su abuelo. Este niño nacería con algunas anormalidades que fueron la gran preocupación de su padre ya que su madre sólo lo vería durante los primeros cuatro días de su vida al morir esta el 12 de julio de 1545 con dieciocho años de edad y tan sólo veinte meses de casada.
Esta repentina muerte fue achacada a hechos inverosímiles propios de la cultura de la época como que hubiese comido un limón poco tiempo después del nacimiento o la ingesta de un melón al descuido de sus camareras. Sin embargo, en la actualidad la causa de su muerte podemos hallarla en una infección puerperal debido a un parto laborioso en una joven de apenas dieciocho años que tuvo que comportarse como una mujer sin haber estado preparada para serlo.