Carlos I llegó a Yuste en 1557 desde donde quería ayudar a sus hijos en las labores de gobierno y pasar tiempo más tranquila pero algunos sucesos malos como la muerte de su hermana Leonor, la amenaza turca sobre Orán y el protestantismo fueron las causas por las cuales no pudo ni dormir ni descansar y que le dan sufrir aún más.

Ya por la gota y otras enfermedades su cuerpo fue muy débil. Además tenía muchos ataques de gota muy dolorosas, fue casi incapaz de andar o manejarse con sus manos. .En su epoca no habían ni remedios contra la enfermedad ni analgésicos.

Todos sus enfermedades mencionadas abajo formaban una interacción que con el tiempo fue demasiado fuerte para su cuerpo. Finalmente fue otra enfermedad que le acabó la vida: el paludismo. En agosto sientó dolores de cabeza y de estómago, tenía una fiebre alta. Todo eso significaba el comienzo del fin de su vida y esto sabía Carlos por lo que quería ponerse en paz con todos sus servidores.

El 19 de septiembre  recibe la extremanució y pide el crucifijo con el que había muerto su mujer. En fin murió el 21 de septiembre de 1558.