Macao no se desarrolló como establecimiento importante hasta la llegada de los portugueses en el siglo XVI.

Habiéndose establecido en Goa en 1510 y Malaca en 1511, los primeros portugueses llegaron en la costa de China a 1513 desde Malaca. Arribaron a la Isla Lintin, en el estuario del río Zhujiang (Río de Perla de los portugueses) y erigieron ahí un jalón de piedra reclamando la isla para el rey de Portugal.

Cuando las flotas portuguesas llegaron a los alrededores de Haojing’ao en 1517 y 1518, los funcionarios chinos expresaron su disgusto por las violaciones de la soberanía de China. Los portugueses fueron expulsados a la fuerza de la costa de Cantón  en 1521.

Después de un naufrafio de un navío portugués en 1536, se permitió a comerciantes portugueses fondear en Haojingao. En el año 1553,  comenzaron a establecer almacenes de comercio en tierra allí.

Aunque otros intentos portugueses de establecerse en otras islas de la costa sur de China habían fallado, Macao prosperó. Los portugueses establecen bases de operaciones allí para el comercio con China, sobre todo Cantón, y para el comercio con Japón.

Tanto los comerciantes portugueses como chinos afluyeron a Macao, y rápidamente se hizo un polo importante en el desarrollo del comercio de Portugal con India, China del sur, Japón, y Asia del Sudeste. Lisboa obtuvo el arrendamiento de Macao a cambio de rendir pleitesía a Pekín en 1557, y en aquel mismo año, estableció allí una población amurallada.

En 1563, el número de habitantes de Macao era de un millar de portugueses casi todos casados con malayas y japonesas convertidas al cristianismo y unos pocos millares de malayos de Malaca, indios y esclavos africanos.Macao se convertía en la puerta de entrada del cristianismo para todo el imperio chino.

Ruinas de la Catedral de San Pablo, construido desde 1582 hasta 1602 por Jesuita en Macau.