La llegada en 1516 a España del nuevo rey Carlos I fue vista por los conversos como una posibilidad de terminar con la Inquisición, o al menos de reducir su influencia. Sin embargo, a pesar de las reiteradas peticiones de las Cortes de Castilla y de Aragón, el nuevo monarca mantuvo intacto el sistema inquisitorial.
Durante el siglo XVI, sin embargo, la mayoría de los procesos no tuvieron como objetivo a los falsos conversos. La Inquisición se reveló un mecanismo eficaz para extinguir los escasos brotes protestantes que aparecieron en España. Curiosamente, gran parte de estos protestantes eran de origen judío.
El primer proceso relevante fue el que se siguió contra la secta mistica conocida como los «alumbrados» en Guadalajara y Valladolid. Los procesos fueron largos, y se resolvieron con penas de prisión de diferente magnitud, sin que ninguno de los integrantes de estas sectas fuese ejecutado. No obstante, el asunto de los «alumbrados» puso a la Inquisición sobre la pista de numerosos intelectuales y religiosos que, interesados por las ideas erasmistas, se habían desviado de la ortodoxia (lo cual es llamativo porque tanto Carlos I como Felipe II fueron admiradores confesos de Erasmo de Rotterdam). Éste fue el caso del humanista Juan de Valdés, que debió huir a Italia para escapar al proceso que se había iniciado contra él, o del predicador Juan de Avila, que pasó cerca de un año en prisión.
Los principales procesos contra grupos luteranos propiamente dichos tuvieron lugar entre 1558 y 1562, a comienzos del reinado de Felipe II, contra dos comunidades protestantes de las ciudades de Valladolid y Sevilla. Estos procesos significaron una notable intensificación de las actividades inquisitoriales. Se celebraron varios autos de fe multitudinarios, algunos de ellos presididos por miembros de la realeza, en los que fueron ejecutadas alrededor de un centenar de personas. Después de 1562, aunque los procesos continuaron, la represión fue mucho menor, y se calcula que sólo una decena de españoles fueron quemados vivos por luteranos hasta finales del XVI, aunque se siguió proceso a unos doscientos. Con los autos de fe de mediados de siglo se había acabado prácticamente con el protestantismo español, que fue, por otro lado, un fenómeno bastante minoritario.