A la Reina Isabel le consternaba la salud mental de su hija ya que la abuela de Juana, Isabel de Portugal padecía de locura. La reina Isabel había presenciado muchas veces los episodios de locura de su madre. Esa risa que ahora su hija parecía heredar le recordaba a su madre, Isabel de Portugal, obsesionada con que sus hijos (Alfonso e Isabel) llegaran al trono de Castilla.
Tras su matrimonio con Felipe estos episodios de locura aumentaron ya que Juana, locamente enamorada de su esposo, llevaba muy mal el que su marido le fuera infiel con infinidad de mujeres.
Un día de septiembre de 1506 Felipe contrajo una fiebre terminal y murió. Juana, al recibir la noticia, no derramó una sola lágrima y su actitud contribuyo a las habladurías acerca de la locura de la Reina.
Con la muerte de Felipe, el Rey Fernando vuelve a tomar la regencia de Castilla y decide encerrar a Juana en Tordesillas ya que su enfermedad estaba evolucionando. Ya no dejaba que la bañaran ni la vistieran.
Tras la muerte de Fernando el católico su hijo y heredero Carlos decide mantener a su madre encerrada en Tordesillas, que permaneció allí hasta su muerte en 1555. Fue enterrada en la Catedral de Granada junto a su amado Felipe.