Aunque en los primeros años de reinado de Carlos V, la Inquisición había perdido prestigio, pues su campaña contra los judeoconversos había finalizado y su objetivo ahora ya no estaba tan claro, hacia 1523 la Inquisición ya se había recuperado de la crisis sufrida en los años anteriores. Ciertamente, se fijaron nuevos objetivos: no sólo continuó su incansable persecución del judaísmo, sino que en la era de Lutero dirigió cada vez más su atención a dos grupos, los iluministas (o alumbrados) y los erasmistas, así como también a los luteranos.
Los alumbrados, secta de origen exclusivamente español, creían en la sumisión de la voluntad a Dios y en la capacidad de establecer comunicación personal con la esencia divina por medio del éxtasis, sin que ello conllevara el pecado. Algunos de estos alumbrados encontraron en esta secta el pretexto perfecto para dar rienda suelta a las pasiones sexuales. Y la Inquisición no podía hacer otra cosa que actuar, de manera que mediante un edicto del 23 de septiembre de 1525 condenó la doctrina del iluminismo.
Los iluministas fueron los precursores del protestantismo, de manera que los primeros allanaron el camino a los protestantes en la introducción de su doctrina en España. En 1520 se publicó en Flandes una traducción española del comentario de Lutero a la Epístola a los gálatas, a la que siguió la de su obra Libertad del cristiano. Poco era lo que se sabía en este momento en España sobre Lutero más allá de un rumor general sobre un hereje que se ha levantado en Alemania. Pero alentado por Roma, el inquisidor general Adriano publicó el 7 de septiembre de 1521 el primer decreto contra libros luteranos en España. La actuación de la Inquisición con respecto a presuntos luteranos en España fue torpe, pues no tenían certeza de cuál era su objetivo y eran incapaces de identificar las doctrinas heréticas.
En este contexto entra también en juego el erasmismo, pues las doctrinas de Erasmo se adentran en España también en este mismo momento. En 1516, tras la publicación de su versión del Nuevo Testamento, Erasmo fue invitado a venir a España, aunque finalmente la visita no se llevó a cabo. Erasmo defendía la necesidad de una reforma general de la Iglesia e instaba el retorno a la sencillez de los tiempos apostólicos y se enfrentó a Lutero debido a la cuestión del libre albedrío, con la que no estaba de acuerdo. Entre 1522 y 1525 el movimiento erasmista alcanzó su apogeo en España, sin embargo, también cosechó enemigos. Las órdenes monásticas, objetivo principal de los ataques de Erasmo, permitió que sus enemigos lanzaran una ofensiva contra él y lo acusaron de herejía. Para resolver la cuestión de la ortodoxia de Erasmo se convocó una asamblea en Valladolid en 1527, pero como no se llegó a un punto de acuerdo, se prohibió atacar al erudito, pues no existían pruebas fehacientes que le mostraran como un hereje y proclive al luteranismo. No obstante, la reacción de la Iglesia no fue positiva. Carlos V estaba a favor del erasmismo y la Iglesia no. De manera que la Inquisición, en 1533, durante los cuatro años que se ausentó Carlos V de España (1529-1533), había conseguido asociar, a los ojos de la opinión pública, las enseñanzas de Erasmo con las herejías de Lutero, convirtiendo así a Erasmo en un hereje. De igual manera, a la llegada de Carlos a España, los principales erasmistas españoles se hallaban en prisión, acusados de protoluteranismo, o habían huido del país. Un caso importante dentro de este contexto es el de Juan de Vergara, un hombre de vasta cultura y conocimientos, al que se calumnió con acusaciones de luteranismo, iluminismo y erasmismo.