Quebrantada la salud de la Reina Católica y viendo próximo su fin, Isabel I hizo testamento, designando como heredera del reino castellano a su hija doá Juana, y a su esposo don Fernando como regente, si aquélla no estaba en disposición de gobernar; pues su razón se hallaba muy perturbada desde hacía algun tiempo.
En su testamento doña Isabel la Católica recomendó que no se enajenara nunca de sus reinos la plaza de Gibraltar. También rogaba a sus herederos y sucesores que los indios de América fueran tratados al igual que los súbditos, “como que al emprender el descubrimiento se había tenido en mira, ganas almas para el Cielo y no esclavos para la Tierra.”
El 26 de noviembre de 1504 murió la madre de Juana I de Castilla en Medina del Campo.
