En 1536, el emperador procedió a una reorganización general de sus fuerzas en Italia mediante la publicación de la Instrucción de Génova, en la que los Tercios son mencionados por primera vez.
Toda la infantería española se agrupaba en Tercios, aunque no als de otras precedencias (alemana, italiana y borgoña) que también servían a sueldo. La Instrucción distinguía tres Tercios diferentes: el de Nápoles-Sicilia, el de Lombardía y el de Málaga. Se establecían así tres agrupaciones distintas de compañías, las dos primeras identificadas por su base territorial de las operaciones y la tercera por su zona de procedencia, pues englobaba tropas que, a través del puerto de Málaga, habían sido trasladadas de Túnez a Italia. Al frente de cada grupo había un oficial superior, el maestre de campo, secundado por varios oficiales que formaban la plana mayor o estado coronel. El Tercio surgió, pues, como regulariación de la ya mencionada coronelía. La diferencia radicaba en su condición de unidad regular siempre en pie de guerra, incluso si no se preveía entrada en combate ni existía amenaza inminente.
En este sentido, su implantación respondió más a conveniencias administrativas que a motivaciones tácticas. El sistema de organización militar ligado al Tercio se amplió pronto e incluyó las fuerzas de intervención operativas fuera de la península Ibérica durante todo el año siguiente. El Reino de Sicilia no tardó en recibir un Tercio completo, mientras otros dos quedaban estacionados en Nápoles y en Lombardía. Por haber sido los más antiguos, fueron denominados Tercios Viejos cuando se movilizaron otros nuevos para operar en escenarios distintos. Entre los que fueron creándose, los hubo con presencia continuada, como el de Cerdeña o los llamados Tercios de Mar, que guarnecían las escuadras de galeras que operaban en el Mediterráneo y protegían sus costas de los piratas berberiscos. Otros fueron organizados para campañas concretas. Estos últimos se identificaban por el nombre de su maestre de campo o por el de su escenario de actuación, como el Tercio de Flandes, que defendió los Países Bajos durante las guerras franco-españolas de las décadas de 1540 y 1550. Las derrotas francesas en las batallas de San Quintín (1557) y Gravelines (1558) sentaron las bases de la Paz de Cateau-Cambrésis (1559).
Pero la actividad militar no descendió durante el reinado de Felipe II. A partir de 1567, los Tercios de infantería española adquirieron un enorme protagonismo a raíz de varios episodios, como la rebelión de las provincias de Flandes, la gran ofensiva naval contra los turcos (que se iba a saldar con victoria de Lepanto, en 1571) o la incorporación del reino de Portugal (1580), entre otros.