En 1469, Enrique IV es rey de Castilla. Según historiador John Lynch, Enrique “veía intrigas aragonesas en cualquier rebelión de sus propios súbditos y favorecía una alianza con Portugal o Francia; también había que contar con los defensores de los derechos a la sucesión de la hija de Enrique IV, Juana, cuya legitimidad estaba en litigio, pero a quien el propio Enrique declaró su heredera” (7-8). Isabel y Fernando obtuvieron la legitimación del matrimonio, el trono de Castilla a la muerte de Enrique IV el año 1474, y la unión de las coronas de Castilla y Aragón cuando Fernando sucedió a su padre en 1479. Sólo permanecían fuera de la unión Navarra y Granada–la primera como satélite de Francia; la segunda como reino moro independiente. Sin embargo, la cuestión de Portugal no había sido resuelto. Portugal—cuyo monarca se había casado con Juana, defendía sus derechos y aspiraba incluso a apartar Castilla de los reinos levantinos de la Península, el resultado de lo cual fue la Guerra de Sucesión Castellana.

La crisis producida por la muerte de Enrique IV de Castilla en 1474 alentó la formación de una coalición, cuyo líder fue Alfonso V de Portugal, y que con el apoyo de Luis XI de Francia, invadió Castilla desde Portugal. El resultado de la invasión fue un conflicto bélico de unos 5 años (1475-1479) durante los que los partidarios de Juana intentaron establecer que era Juana, y no Isabel, que tenía derecho al trono de Castilla. La guerra tuvo un carácter internacional a causa de los matrimonios estratégicos entre Isabel y Fernando (heredero de la Corona de Aragón) y Juana y el rey Alfonso V de Portugal. La intervención de Francia también complicó la situación.

A pesar de algunos éxitos iniciales para los partidarios de Juana, la escasa agresividad militar de Alfonso V y la derrota portuguesa en la batalla de Toro llevaron a la desintegración del bando juanista entre 1476 y 1477. Desde luego el conflicto consistió esencialmente en una guerra entre Castilla y Portugal, con un componente naval muy importante en el océano Atlántico, donde las flotas portuguesas prohibían acceso a los españoles a las riquezas de Guinea. Sin embargo, con la Batalla de Toro, todo cambió muy rápidamente. La batalla tuvo lugar en la zona alrededor de Zamora, España el 1 de marzo de 1476, entre las tropas de los Reyes Católicos por un lado y las de Alfonso V de Portugal por otro. La primera parte de la batalla terminó con victoria para Fernando; la segunda, con victoria del príncipe heredero Juan de Portugal, aunque esta victoria tuvo mayores consecuencias, y su padre Alfonso decidió retirarse, debido a una falta de apoyo.

Sin fuerzas, Portugal decidió rendir y la guerra concluyó en 1479 con la firma del Tratado de Alcáçovas, que reconocía a Isabel y Fernando como reyes de Castilla y concedía a Portugal la hegemonía en el Atlántico, con la excepción de las islas Canarias. Juana perdió su derecho al trono y tuvo que permanecer en Portugal hasta su muerte.