En 1521 Manuel I de Portugal murió y le sucedió su hijo Juan III. Las negociaciones entre Portugal y Castilla y Aragón resultaron es la formación de una doble unión hispano-portuguesa. Primero, en 1522, Juan III de Portugal se casó con Catalina de Austria, su prima y la hermana menor de Carlos I. Luego, el 11 de marzo de 1526, Isabel, hermana de Juan, se unió con Carlos I, su primo. La boda se celebró en los Reales Alcázares de Sevilla. Esta doble unión fue mutuamente beneficioso, porque con el matrimonio entre Carlos y Isabel, la relación entre Castilla y Aragón y Portugal se reforzó, mientras el matrimonio entre Juan III y Catalina reforzó la relación entre Portugal y Austria, otra parte del Imperio.
Como ya he dicho, Isabel de Portugal era la segunda hija del rey Manuel I de Portugal (1469-1521) y su esposa María de Aragón y Castilla (1482–1517). Aunque murió joven, Isabel (Lisboa, 24 de octubre de 1503 – Toledo, 1 de mayo de 1539), fue la única esposa de Carlos I de España, emperatriz del Sacro Imperio Romano Germánico. Según el linaje establecido, no fue reina titular de España, porque Juana I de Castilla (1479-1555) vivía sin ejercer su poder, que había sucedido a su hijo Carlos. Sin embargo, como esposa del rey Carlos I, se le considera entre las reinas consortes de España, y de hecho tuvo cierto poder como gobernadora de los reinos españoles, particularmente durante los viajes por Europa de su marido.
Desde el punto de vista económico de la monarquía hispánica, la unión de Isabel y Carlos fue beneficiosa, porque el dote de Isabel era muy grande, así que contribuiría a los ingresos del imperio bajo Carlos, cuyo presupuesto fue enorme y aumentaba año tras año. Además, a pesar de que el matrimonio se realizó por motivos políticos, dicen que fue una pareja feliz, y después de la muerte de Isabel, Carlos nunca volvió a casarse.
El matrimonio produjo cinco hijos incluso Felipe II, el único hombre que sobreviviría la niñez. Isabel de Portugal murió embarazada de su quinto hijo en el palacio de Fuensalida, Toledo, Castilla-La Mancha. Descendencia:
- Felipe (21 de mayo de 1527 – 13 de septiembre de 1598), sucesor de Carlos al trono de España y sus posesiones en América, los Países Bajos, Milán, Cerdeña, Nápoles y Sicilia
- María (21 de junio de 1528 – 26 de febrero de 1603)
- Juan (22 de marzo de 1529 – 1530)
- Fernando (19 de octubre de 1535 – 20 de marzo de 1538);
- Juana (24 de junio de 1537 – 7 de septiembre de 1573), quien en 1552 se casó con su primo hermano Juan Manuel de Portugal, infante heredero de Portugal
- Juan (30 de abril de 1539)