Isabel de Portugal era la segunda hija del matrimonio entre María, hija de los Reyes Católicos, y Manuel I de Portugal. Había nacido en Lisboa el 23 de octubre de 1503. A sus catorce años murió su madre y un par de años después su padre contrajo nuevas nupcias con Leonor, hermana de Carlos. Era una muchacha inteligente, sensible y de un carácter que sabía combinar sensibilidad y firmeza, era a la vez grave y prudente y recordaba al cáracter de su abuela, Isabel la Católica. Gracias a su carácter, pudo dar cariño pero también autoridad a sus hermanos después de la muerte de su madre. Su padre Manuel ofreció una dote de 900000 ducados al futuro marido de su hija quien sería Carlos. El encuentro de los dos cortejos, el portugal que acudía a entregar a Isabel y el español que se presentaba a la cita para acogerla, fue un gran espectáculo: la suntuosidad de los trajes, el lujo desplegador por las dos noblezas empeñadas en rivalizar en riqueza, el estruendo de las músicas, todo contribuía a resaltar la ceremonia. El momento de la despedida de la nobleza portuguesa con Isabel fue muy emocionante, rindió homenaje a la infanta que se convertía en emperatriz. Isabel dejaba atrás su patria, su familia, sus amigos, y también su lengua materna. Llegó a Sevilla el 3 de marzo de 1526. Iba muy hermosa toda vestida de raso blanco y oro, tocada con una gorra de raso blanco, y en ella una pluma de lo mismo. Carlos tardó siete días en llegar a Sevilla, así que se casaron el 11 de marzo de 1526 en los Reales Alcázares de Sevilla y quedaron en Sevilla hasta entrado el mes de mayo. Después la nueva pareja fue a Granada, pasando por Córdoba, para su luna de miel donde visitó el palacio de la Alhambra. Prolongó su estancia hasta fines del año de 1526. Fue en Granada donde Carlos e Isabel engendraron a su primer hijo, Felipe que naciera en Valladolid. Isabel era la princesa más atractiva de toda Europa: era rubia, de ojos azules, realmente hermosa y con un cuerpo muy bien proporcionado y agraciado. Tenía 22 años y sabía más de artes, de cultura, de política y de ciencias de la vida que la mayoría, por no decir todas las princesas de la época y de las épocas venideras. Contaba con el favor de los castellanos porque hablaba castellano, era muy inteligente y tenía dotes para poder gobernar. De hecho, la Emperatriz daría muestras de un gran sentido del deber para con sus obligaciones reales y su dignidad. Así durante sus ausencias, Carlos pondría como regente o representante a su esposa. Desde el primer momento, Carlos se quedó enamorado de ella y nació entre ambos un amor pleno. Fue su compañera de vida y amor y su más íntima consejera. Tuvieron una relación de completo acuerdo y armonía, formaban una unidad perfecta. Carlos tuvo un gran afecto por la mujer que le dio tres hijos: Felipe, María y Juana. Su muerte fue un golpe muy duro para Carlos, tenía 39 años y no volvió a casarse. Así lo que era primero un matrimonio de conveniencia acabó siendo un matrimonio de amor.
