Para Carlos V, la guerra contra el Imperio otomano no constituía una prioridad, a pesar de ser el rey más indicado para liderar, al modo medieval una cruzada contra los infieles. Así, mientras se encontraba inmerso en las guerras contra Francia, delegó sus posesiones austriacas, es decir, las heredadas de los Habsburgo, en su hermano Fernando y solo intervino con un cuerpo expedicionario para evitar la caída de Viena en manos de los turcos.
Sin embargo, la defensa del Mediterráneo constituyó una gran preocupación para el emperador. Contaba para ello con las plazas conquistadas por Fernando II de Aragón en el norte de África; sin embargo, carecía de una flota poderosa. Carlos V no solucionó esta deficiencia y se limitó a realizar en esta zona algunas acciones espectaculares de éxito muy limitado, como la toma de Túnez (1535), muy importante para la protección de las costas italianas. Sin embargo, la expedición imperial a Argel fracasó en 1541, y los turcos acabaron conquistando Trípoli y Bugía. Los recursos imperiales se dedicaron a otras campañas militares, y el Mediterráneo occidenteal se conviertió en un mar inseguro.
Contra Alemania, el emperador tuvo que afrontar también la difusión del protestantismo por el norte de Europa, ya que Martín Lutero y sus seguidores estaban extendiendo la Reforma en el Imperio con el apoyo de algunos principados alemanes, que veían en el desmantelamiento de la Iglesia católica un excelente medio de aumentar sus posesiones y rentas y de independizarse aún más del emperador. Carlos V, por su parte, condenaba públicamente las teorías de Lutero, pero no apoyaba al papado en sus deseos de ruptura total con los protestantes; por el contrario, se mostraba partidario de llegar a un compromiso entre luteranos y católicos, para lo cual solicitó al papado que convocara un concilio para acercar ambas posturas. De esta forma, él podría restablecer su autoridad y atraer a los príncipes alemanes contra Francia.
La convocatoria del concilio, sin embargo, se retrasaba. Entre tanto, en 1531 los príncipes protestantes formaron la Liga de Esmalcalda, una coalición de gran influencia política y poder militar. Finalmente comenzaron las sesiones del esperado concilio en Trento (Italia, 1545-1563), aunque sufrió numerosas interrupciones debido a las guerras entre Francias y los Habsburgo. Los protestantes (ya entonces muy influyentes en el norte de Alemania y en los países nórdicos de Europa) se negaron a asistir a la mayoría de las sesiones. El concilio impulsó la Contrarreforma, un movimiento que reafirmó el dogma católico y la disciplina dentro de la Iglesia y selló la ruptura total con los portestantes.
La única alternativa que le quedó a Carlos V fue la guerra, que él no presentó como religiosa, sino política, contra los príncipes que se habían rebelado contra su autoridad. En 1547 derrotó a las tropas de la Liga de Esmalcalda en Mühlberg (Alemania), a orillas del río Elba.
Sin embargo, el emperador no logró la reconciliación religiosas ni impuso su autoridad política (rechazada incluso por los príncipes católicos). Enfrentado de nuevo a Francia y a los turcos, aceptó su derrota y la imposibilidad de lograr la unidad religiosa de Alemania, de Europa y del Imperio: por ello, en 1555 firmó la Paz de Augsburgo. En esta época (1555-1556), Carlos V renunció a sus dominios en la península ibérica, en Borgoña y en Italia en favor de su hijo Felipe. Posteriormente cedió sus derechos imperiales y dominios austriacos a su hermano Fernando.
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