La conquista de Perú, y la expansión hacia el interior
Con la conquista 
de Perú a manos de Francisco Pizarro comenzó la tercera etapa de los descubrimientos. La base de partida de la expedición fue el Istmo, siendo respaldado por Nueva España. En los años 20 del siglo XVI se sabía de la existencia de un imperio rico en oro llamado Pirú. Gracias a las Capitulaciones de Toledo (1529) Pizarro, Almagro y Luque obtuvieron autorización para conquistar el territorio, esta conquista se llevó a cabo entre 1530-1532.
Una vez conquistado Perú, y tomando como base Panamá, se inició una política de expansionismo hacia los cuatro puntos cardinales, hacia el norte Sebastián de Benalcázar descubre entre 1536-1538 los ríos Cauca y Magdalena, aparte de explorar Popayán, y Guayaquil. Por su parte Francisco de Orellana, buscó el famoso territorio de El Dorado (fracasando en la empresa) navegó por primera vez por el Marañón-Amazonas saliendo al Atlántico (1541). Fue este un descubrimiento sensacional pues representaba la posibilidad de navegar desde la costa peruana hasta el Atlántico. La penetración hacia el Sur partiendo del Perú permitió alcanzar Chile. Correspondió la iniciativa a Diego de Almagro quien cruzó los Andes y alcanzó el valle del Aconcagua. En 1540 Pedro Valdivia continuó la exploración de Chile por la costa, fundando la ciudad de Santiago. Hacia el este se alcanzó el norte argentino y la zona de Tucumán, fundándose la ciudad de Córdoba. Por último, hacia el oeste y por vía marítima, se alcanzaron multitud de islas en el Pacífico.