La penetración desde la costa del Caribe.
Como base para llevar a cabo estas penetraciones se eligieron dos ciudades, Santa Marta y Santa Ana de Coro, siendo la más importante la efectuada desde Santa Marta. Desde esta última se utilizó el rio Magdalena como vía natural para acceder al interior del continente. En la expedición mandada por Jiménez de Quesada, en un principio, tenía como objetivo alcanzar el Perú, permitió explorar una gran porción territorial entre 1536-1537 a la que se le puso por nombre Nueva Granada (actual Colombia).
Desde la ciudad de Santa Ana de Coro, partieron también expediciones hacia el interior, pero con la particularidad de que sus protagonistas eran alemanes, esto es debido a la presencia de banqueros alemanes en España para llevar a cabo el sostenimiento de la economía del imperio español. A cambio de tratar sus empresas, Carlos V otorgó a estos alemanes derechos para colonizar y descubrir en América. Entre esto alemanes destaca Ambrosio Ehinger quien lanzó una expedición al interior en búsqueda del Dorado, exploró la laguna de Maracaibo y fundó la ciudad de idéntico nombre; la cual se convirtió en base de futuras exploraciones. Tras morir en combate con los indios, sus exploraciones las proseguiría Nicolás Federman, aunque tampoco pudo hallar El Dorado.
La expansión por el río de la Plata.
La expansión por el rio de la Plata se llevó a cabo desde la propia Península, sin necesidad de utilizar bases previas como en otras ocasiones ( las Antillas, el Perú…) .Esta, es una área aislada, como consecuencia de una geografía difícil (quedando al oeste los Andes ) a la que se une el acoso de los portugueses desde el Brasil. Por ello su conquista fue larga, extendiéndose prácticamente a lo largo de todo el siglo XVI.
Entre 1536-1556 se consiguió explorar el Chaco (a la búsqueda de la Montaña de Plata, uno de los mitos del área), remontarse los ríos Paraná y Paraguay, en este contexto desempeñaron un papel fundamental Pedro de Mendoza, Juan de Ayolas y Domingo Martínez de Irala.
