La creación de una gran biblioteca en España la tuvo en mente Felipe II desde 1556, pero retrasó el proyecto el «carácter trashumante» de la corte española. La decisión real de elegir en 1559, con la corte ya establecida en Madrid, a San Lorenzo de El Escorial como lugar de construcción fue una decisión polémica, que contravino las indicaciones de sus asesores, los cuales se inclinaban por localidades como Salamanca, ya que contaban con una gran tradición universitaria y por tanto con mayor interés, a nivel general, por los libros.
Los primeros libros llegan en 1565. Eran sobre todo libros en castellano y de carácter religioso. Las primeras adquisiciones se corresponden con 42 duplicados de libros ya existentes en palacio. En 1566 llegó una segunda remesa de libros, entre los que se encontraban piezas de gran valor como el Códice Áureo, el Apocalipsis Figurado o, el más importante, un De baptismo parvulorum de San Agustín, supuestamente escrito de su puño.
Felipe II reunió un grupo de personalidades destacadas de todo tipo de disciplinas para asesorarse en la adquisición de copias. La tendencia en estos años será adquirir originales y volúmenes antiguos, pues según el criterio de la época esto era lo que hacía a una biblioteca «aventajada sobre otras». Envió emisarios a los poseedores de las mejores bibliotecas para solicitar su venta. Entre las colecciones más importantes adquiridas figura la de Diego de Mendoza, una de las personas más cultas de su época.
Como punto de interés, en 1671 sufrió un terrible incendio de 3 dias, perdiéndose 2.000 códices irremplazables. Actualmente cuenta con unos 40.000 volúmenes, incluidos 600 incunables y unos 4.000 manuscritos en latín, árabe, griego y hebreo.