En un principio, su educación estaba bajo la dirección de maestros borgoñeses que le enseñaron la historia del ducado. Toda su educación se desarrolló en Flandes y fue colmada de cultura flamenca.
Más tarde su abuelo, Fernando el Católico, consciente de que algún día podía ocupar su trono, envió a un instructor que le enseñaría la lengua y las costumbres españolas. Este instructor fue:
Luis Cabeza de Vaca de Jaén.
Nacido en Jaén en 1495, era humanista y obispo. Conocedor del pensador cristiano, Erasmo de Rotterdam.
Fue uno de los primeros profesores del futuro rey Carlos I, en 1505.
Fue defensor de la espiritualidad de la iglesia y opuesto a la rigidez de la religión que acabaron imponiendo otros clérigos con la Inquisición.
Fue nombrado obispo de Canarias en 1521, trasladado a Salamanca en 1530 y en 1537 a Palencia.
Otro profesor de Carlos, este si de origen holandés fue:
Adriano de Utrech:
Nació en 1459, fue educado en la devotio moderna, en el amor a la virtud y a la ciencia.
Fue profesor de teología de la Universidad de Lovaina, de la que fue rector. Más tarde, cuando Carlos tenía 6 años, su abuelo Maximiliano le encargó su educación a Adriano, de la que se encargó durante unos 10 años.
Además Adriano tuvo que mediar con Fernando el Católico, pues éste quería como futuro rey de España a su otro nieto Fernando. Finalmente Adriano consiguió que Carlos fuera nombrado rey de España. Más tarde Carlos I se lo agradecería impulsando su ascenso en la carrera eclesiástica.
En 1520, fue nombrado regente de España durante la ausencia de Carlos V por razón de su designación como cabeza del Sacro Imperio.
El 9 de enero de 1522, fue nombrado Papa, sustituyendo a León X, con el nombre de Adriano VI.