Del matrimonio con Juana I de Castilla nacieron seis hijos:

Leonor (1498 – 1558)              Archiduquesa de Austria. Casada con el rey Manuel I de Portugal.

Carlos (1500 – 1558)         Rey de España (1516–1556) y de Nápoles (1516–1554), bajo el  nombre de Carlos I; y Emperador del Sacro Imperio Romano  Germánico (1519–1558), bajo el nombre de Carlos V.

Isabel (1501 – 1526)  Archiduquesa de Austria. Casada con el rey Cristián II de Dinamarca.

Fernando (1503 – 1564) Archiduque de Austria, Rey de Bohemia (1526–1564), de Hungría  (1526–1538, 1540–1564) y Emperador del Sacro Imperio Romano  Germánico (1558–1564). Casado con Ana Jagellón de Hungría                           y Bohemia.

María (1505 – 1558)              Archiduquesa de Austria. Casada con Luis II Jagellón, Rey de  Hungría, Bohemia y Croacia.

Catalina (1507 – 1578)      Archiduquesa de Austria. Casada con el rey Juan III de Portugal.

Y en aquella época de tanta mortandad, tanto al parir como de la infancia,  Juana daba a luz con facilidad, se reponía rápidamente, criaba  personalmente a sus hijos sin ayuda de nodrizas, no se le murió ninguno  y ninguno estaba loco. Y los seis fueron reyes.

Carlos, el primogénito fue Rey de España y Emperador de Alemania,  siendo el hombre más poderoso de la Tierra.

Leonor fue Reina de Portugal y después de Francia.

Fernando sucedió a su hermano como Emperador de Alemania.

Isabel fue Reina de Dinamarca.

María fue Reina de Hungría y de Bohemia.

Catalina fue Reina de Portugal.