El 21 de febrer de 1632, Galileu, protegit pel papa Urbà VIII i el gran duc de Toscana Fernando II de Médicis, publica a Florència el seu diàleg sobre els principals sistemes del món, on es burla implícitament del geocentrisme de Ptolomeu. El Diàleg és alhora una revolució i un veritable escàndol. El llibre és en efecte obertament pro-copernicà, ridiculitzant audaçment la interdicció de 1616 (que no serà aixecada fins a 1812: a verificar).
El Diàleg es desenvolupa a Venècia durant quatre jornades entre tres interlocutors: Filip Salviati, un Florentino seguidor de Copèrnic, Giovan Francesco Sagredo, un venecià il•lustrat sense prendre partit, i Simplicio, un mediocre defensor de la física aristotèlica, un personatge que alguns volen veure inspirat en Urbà VIII. Però, mentre que se li retreu el caràcter ostensiblement pejoratiu del nom, Galileu respon que es tracta de Simplicio de Cilicia. Molts autors coincideixen que Galileu no esperava aquestes reaccions ni que el Papa reaccionés posicionant-se entre els seus enemics.
En aquests quatre dies de discussió, Galileu, encara que ho tenia prohibit pel decret de 1616, presenta dues noves proves de caràcter experimental i observacional a favor de la teoria copernicana. La basada en el moviment de les marees, errònia, i la basada en la rotació de les taques solars, encertada i que refutava tant la ptolemaica (ja descartada per les fases de Venus), com la de Tycho Brahe, en el defensa de la qual s’havien refugiat els jesuïtes del Col•legi Roma. Això va motivar la intervenció de la Inquisició, que només li permetia a Galileu el presentar la teoria com a mera hipòtesi, i no presentar proves al seu favor.
D’altra banda, Galileu té a Roma poderosos enemics, fonamentalment entre els jesuïtes del Col•legi Roma, especialment Christopher Steiner i Orazio Grascci, els qui es consideraven la branca intel•lectual de l’Església, i els qui van poder ser els qui van iniciar el rumor que el Papa Urbà era, en realitat, el simpàtic però poc brillant Simplicio. Això va ser molt perjudicial per a Galileu, doncs a Roma era molt coneguda l’enorme autoestima del Papa. D’altra banda, tampoc va ajudar a Galileu l’escriure la seva citada obra en llengua vulgar, en comptes de fer-ho en l’idioma culte utilitzat llavors entre els homes de ciència, el llatí, doncs a l’Església no li agradava que les obres arribessin directament a l’home del carrer.
El procés realitzat per la Inquisició va ser irregular, doncs a pesar que el llibre havia passat el filtre dels censors, se li acusava d’introduir doctrines herètiques. ja que això deixava en mal lloc a aquests censors, l’acusació oficial va ser de violar la prohibició de 1616. Galileu va ser requerit per presentar-se a Roma, no obstant això, estava summament malalt i esgotat, i ja explicava 68 anys, per la qual cosa es va demorar a acudir, a més de que en aquests moments existia una epidèmia de pesta a Itàlia. Encara que va presentar certificats mèdics al•legant aquestes circumstàncies, a la fi de desembre de 1632 va ser comminat a acudir immediatament de grau o per força. Que no era voluntat seva el retardar el viatge ho prova el que, a causa de la pesta, fora retingut per espai de 42 dies per abandonar la Toscana. D’altra banda, el tracte rebut durant el procés va ser correcte, allotjat a les habitacions del palau de la Inquisició, i rebent totes les atencions que necessitava, si ben no va ser cap tracte especial diferent a la resta d’altres personalitats importants i persones de la seva condició.
El procés va començar amb un interrogatori el 9 d’abril de 1633, on Galileu no reconeix haver rebut expressament cap ordre del cardenal Bellarmino. D’altra banda, aquesta ordre apareix en un acta que no estava signada ni pel cardenal ni pel propi Galileu. Amb proves frèvoles és difícil realitzar una condemna, per la qual cosa és comminat a confessar, amb amenaces de tortura si no ho fa i promeses d’un tracte benvolent en cas contrari. Galileu accepta confessar, la qual cosa duu a terme en una compareixença davant el tribunal el 30 d’abril. Una vegada obtinguda la confessió, es produeix la condemna el 21 de juny. L’endemà, en el convent romà de Santa Maria Sopra Minerva, li és llegida la sentència, on se li condemna a presó perpètua, i se li commina a abjurar de les seves idees, cosa que fa seguidament. Després de l’abjuració el Papa commuta la presó per arrest domiciliari per a tota la vida. Giuseppe Baretti va afirmar que després de l’abjuració Galileu va dir la famosa frase «Eppur si muove» (i no obstant això es mou) però segons Stillman Drake Galileu no va pronunciar la famosa frase en aquest moment ja que no es trobava en situació de llibertat i sens dubte era desafiadora fer-ho davant el tribunal de cardenals de la Inquisició. Per Stillman si aquesta frase va ser pronunciada ho va anar en un altre moment.
El text de la sentència va ser difós per onsevulla: a Roma el 2 de juliol i a Florència el 12 d’agost. La notícia arriba a Alemanya a la fi d’agost, a Bèlgica al setembre. Els decrets del Sant Ofici no es publicaran mai a França, però, prudentment, René Descartis renúncia a la publicació del seu Món.
Molts (entre ells Descartis), en l’època, van pensar que Galileu era la víctima d’una confabulació dels jesuïtes, que es venjaven així de l’afront sofert per Horazio Grassi en el Saggiatore.