El 31 de marzo de 1578, Juan de Escobedo, secretario de Juan de Austria, fue asesinado por unos espadachines en Madrid. Pronto, la mujer y el hijo del secretario demostraron la implicación de Antonio Pérez en el asesinato, aunque estuviera en Alcala este día . ¿ Pero que occurió realmente ? Para saberlo tenemos que remontarnos al año antes.
Durante la estancia de Don Juan de Austria en Flandes, Juan de Escobedo quedó su última y mejor contacto con el Rey. Antonio Pérez, que ya tenía un gran papel en el alejamiento de Juan de Austria del corte, se pusó a cizañar las conversaciones de ambos. Convinció al Rey de que Escobedo declaraba que el Rey y sus decisiones eran contestables y que le quería reemplazar por Don Juan de Austria. Además aconsejó el Rey de eliminarle.
Luego, el Rey envió una carta a su secretario para decirle que acabara con Escobedo. Trás unas tentativas de envenenamiento, Pérez contrató hombres para matarle, mientras él se escondería en Alcala. 
Muchas fuentes demuestran que Antonio Pérez deseó la muerte de su compadre porque esté sabía que era parte de un tráfico secretos de Estado, y era consciente de las relaciones que cultivaba el secretario real con la favorita del Rey, la Princesa de Eboli y amenezaba de contarlo todo a Felipe II.