Tras un gran festín para celebrar que Don Juan Manuel había tomado posesión  del castillo de Burgos, los invitados dieron un paseo a caballo y jugaron a la  pelota. Al concluir la partida, Felipe el Hermoso, exhausto y acalorado, bebió  con avidez de un botijo de agua helada. Al día siguiente se levantó con fiebre  pero se fue de caza. Cuando volvió estaba tan enfermo que ya no pudo  levantarse, a la semana había fallecido. Era el 25 de Septiembre de 1506.

Se dice que los síntomas que manifestó Felipe fueron: alta fiebre, dolor en  el costado, una gran cantidad de manchas pequeñas entre negras y coloradas  por todo el cuerpo e infección en la lengua y el paladar. Existen varias hipótesis  que se han barajado como causas de su fallecimiento: por enfriamiento, por la  peste o por envenenamiento. Por supuesto, siempre que un miembro de la  realeza moría de repente en semejantes circunstancias había sospechas de  envenenamiento.

Durante sus últimos días, su esposa la reina Juana le cuidó con esmero y  dedicación sin apartarse de su lado, ni de noche y ni de día le abandonaba.  Le daba de comer y beber ella misma, exhortaba siempre a su agonizante  marido para que tomase las medicinas que los médicos le habían mandado  y ella misma, aun estando en avanzado estado de gestación, las probaba y  tomaba grandes tragos para darle ánimos y para que hiciese como ella. Sin  descomponerse en ningún momento, Juana defiende primero como puede  la vida de su esposo y acepta después su muerte.