-Su primer matrimonio tuvo lugar el 15 de noviembre de 1543 con María Manuela de Portugal (1527-1545).
Tuvieron un único descendiente:
Carlos de Austria (1545 – 1568), Príncipe de Asturias.
-Su segundo matrimonio tuvo lugar el 25 de Julio del año 1554 con María I de Inglaterra (1516-1558), en Winchester.
No tuvieron descendencia alguna.
– Su tercer matrimonio sucedió el 22 de junio de 1559 con Isabel de Valois (1545-1568).
Del cual tuvieron dos hijas:
Isabel Clara Eugenia (1566 – 1633), casada con su primo hermano, el Archiduque Alberto de Austria.
Catalina Micaela (1567 – 1597), casada con Carlos Manuel I, Duque de Saboya.
– Su cuarto matrimonio fue el 12 de noviembre de 1570 con Ana de Austria (1549-1580).
Tuvieron cuatro hijos y una hija:
Fernando (4 de diciembre de 1571 – 18 de octubre de 1578), Príncipe de Asturias.
Carlos Lorenzo (12 de agosto de 1573 – 30 de junio de 1575).
Diego Félix (15 de agosto de 1575 – 21 de noviembre de 1582), Príncipe de Asturias.
Felipe (14 de abril de 1578 – 31 de marzo de 1621), Príncipe de Asturias y futuro rey de España como Felipe III.
María (14 de febrero de 1580 – 5 de agosto de 1583).