Su primera actuación con polémica estuvo relacionada con el hijo transtornado del rey Felipe II, su sobrino y príncipe de España.
Carlos era hijo de los dos nietos de Juana la Loca, con lo que llevaba una fuerte carga genética, que a lo largo de su vida se pudo mostrar en numerosas ocasiones. Físicamente también era débil; era de estatura baja, su cara era fea y desagradable, su complexión melancólica…. No se observó en él interés por los estudios, las armas y el caballo ni a otros entretenimientos honestos y agradables, sino simplemente a molestar al prójimo…. Mandando que azoten a personas que le parecen de poca consideración, y odiaba a muchos mortalmente. Manifiesta inclinación grande en molestar a los demás. Habla con dificultad y sus discursos carecen de ilación. El propio Don Carlos escribía. “Lista de mis enemigos: el Rey, mi padre, Ruy Gómez de Silva, -Príncipe de Éboli-, la Princesa de Éboli, el duque de Alba y muchos más”
Su padre intentó buscarle esposa, primero con María Estuardo, luego con Margarita de Valois y finalmente con la archiduquesa Ana de Habsburgo. Finalmente desistió aconsejado por el duque de Alba.
Don Carlos pensó que la boda con María Estuardo no fue posible debido a la oposición de su padre, lo que aumentó su rencor. Además se quejaba de
que el Rey no le incorporaba a las tareas de gobierno.
A pesar de todo esto, con Don Juan de Austria, tío suyo, pero de la misma edad, fueron buenos amigos, Juan siempre le apreció mucho,desde que le conoció, hasta la muerte del propio Don Carlos.
Por aquella época, en 1567, el Rey no le nombra Gobernador de Flandes, Don Carlos decide huir de España y pasar a los Países Bajos para hacerse cargo del gobierno de esas tierras pero necesita la ayuda de Don Juan ,ya Capitán General de la Mar, prometiéndole por su colaboración el Reino de Nápoles. Le pide las galeras necesarias para viajar hasta Flandes. Pero Don Juan se mantuvo fiel al Rey, y confesó la conjura del Príncipe. Don Juan vuelve a ver al Príncipe en privado y éste le amenaza con la espada porque no le dice lo que piensa el rey. El 18 de Enero de 1568, el rey encarcela personalmente a su hijo. Don Juan lleva luto por él hasta que el rey le reprende; hasta que, posteriormente, fallece en extrañas circunstancias.