Como lo que entendemos del sobrenombre El tirano de Lope de Aguirre, una vez iniciada la marcha, quedaron evidentes las duras condiciones que les esperaban. Ante los inesperados peligros del río, por ejemplo, las fieras e insectos, los expedicionarios tuvieron que hacer frente también a los mosquitos, las fiebres e incluso la escasez de alimento, sin contar con las diferentes poblaciones de indios, entre los cuales, algunas hostiles fueron encontrando a su paso. Es decir, se les estaban acercando uno de los peligros más horribles.
Además, otra cosa mala para ellos ocurrió. Las primeras suspicacias y conatos de motín tampoco tardaron en aparecer. Pasando las semanas, y después de más 700 leguas recorridas sin novedades sobre Omagua y El Dorado, empezaron a surgir las sospechas sobre los indios brasiles, los cuales decían conocer el paradero de las ricas tierras. Muchos hombres también empezaron a hablar mal del gobernador, que pasaba los días solazándose con su amante mestiza, a la cual muchos culpaban dehaber hechizado a Ursúa y cambiar su carácter, mientras que ellos iban sufriendo diversos padecimientos. Las voces comenzaron a pedir el regreso al Perú. Cuando trascendieron este deseo, Ursúa castigó a los insurrectos a remar en su barca, como podemos imaginarnos, una humillación que muchos no iban a perdonar,
Fue así como se tejió la traición contra Pedro de Ursúa. Entre los cabecillas de esta rebelión estaban Fernando de Guzmán, Lorenzo de Salduendo y, claro, Lope de Aguirre. Además, así fue como el 1 de enero de 1561, una docena de hombres se acercaron sigilosamente hasta la tienda del gobernador, mientras éste dormía. Como lo recordaba Francisco Vázquez, autor de una de las crónicas más conocidas sobre los hechos:
“…se juntaron con el dicho D. Fernando hasta doce destos traidores, dejando prevenidos otros amigos y secuaces que, en oyendo su voy y apellido, acudiesen con sus armas y fueron al aposento del gobernador, y hallándolo solo, como solía estar, acostado en cama, le dieron muchas estocadas y cuchilladas, y él se levantó y quiso huir y cayó muerto entre unas ollas en que le guisaban de comer”.
Pedro no fue la única víctima en esa terrible noche. Juan de Vargas, teniente del gobernador, también fue atravesado por el filo de una espada traicionera. Una vez terminado la conspiración, Fernando de Guzmán fue nombrado general, mientras Lope de Aguirre se aseguraba el puesto de maese de campo y otros de los conjurados recibían también importantes cargos , a pesar de que en su mayoría no estaban bien preparados para hacerlo.
Un poco más tarde, Guzmán y sus más allegados se decidieron a redactar un escrito en el que se referían los desmanes y errores supuestamente cometidos por su legítimo gobernador. Ese escrito pretendía servir de excusa por el crimen frente al rey Felipe II, y se quiso que todos los participantes en la conjura estamparan su firma en él. El primero en hacerlo fue Guzmán, acompañando la firma de la palabra “general”. A continuación “el Tirano”, Lope, hizo lo propio y aunque, sin hipocresías, escribió: “Lope de Aguirre, traidor”. Más tarde, aprovechó el momento y desveló sus auténticas intenciones. Lope declaró que asesinar al gobernador del rey, representante de éste en la jornada, equivalía a levantarse contra el monarca, crimen para el que no había perdón posible. Entonces propuso dar marcha atrás y el regreso al Perú, con el fin de conquistarlo y declarar un reino independiente del peninsular. Para esto, decidió nombrar a Guzmán como príncipe del reino que pretendían hacer suyo, bajo el título de Fernando I el sevillano, mientras Aguirre desempeñaba con el mando militar.
Desde ese momento las sospechas se hicieron graves entre los otros miembros de la expedición. Todos dormían con el arma cerca, por temor a un navajazo, una estocada o un disparo de arcabuz. Y tenían razón. Tras la muerte de Ursúa, y pese a los acuerdos alcanzados entre los conjuradores y el resto de hombres, se extendió poco a poco la indisciplina y ocurrieron los asesinatos. Muchos de estos se produjeron, precisamente, por temor a los asesinatos y nuevas traiciones inesperadas. Así murieron a manos de Lope de Aguirre, por ejemplo, Cristóbal Fernández, Juan Alonso de la Bandera, la mestiza doña Inés, el capitán Alonso de Montoya o el almirante Miguel Robledo, así como Lorenzo de Salduendo, guardia del general Guzmán. En medio de este caos, Lope se destacó como el auténtico caudillo de los marañones, pues Francisco de Guzmán era sólo un títere que seguía sin saber los planes de Lope.
A pesar de su gran poder, respaldado por un pequeño ejército personal de más o menos cuarenta hombres, Lope quiso seguir adelante a una nuevo conspiración en su contra, y se decidió a acabar con el “príncipe” Guzmán y sus colaboradores más cercanos. En esta nueva refriega cayeron entre otros el sacerdote Alonso de Henao, a quien Aguirre atravesó de una estocada mientras dormía, pinchándolo en su camastro como a un animal. Luego se dirigió a casa de Guzmán y después de matar a sus más allegados, tocó el príncipe. Entre el Tirano y algunos de sus secuaces, acabaron con su vida mediante estocadas y arcabuzazos. Llegaba de esta manera a su fin, el corto reinado de un príncipe todavía sin tierras que gobernar.