María Ana de Austria y Mendoza nació en Madrid, concretamente en el palacio de la princesa de Eboli, el año 1568. Era hija de Juan de Austria y de María Mendoza, dama de la infanta Juana de Austria, princesa viuda de Portugal.
A muy temprana edad quedó huérfana, siendo cuidada hasta los siete años por Magdalena de Ulloa. Y tiempo después fue enclaustrada en el convento de Madrigal de las Altas Torres como petición de Felipe II.
En el año 1589 profesa en el Monasterio de Nuestra Señora de Gracia el Real de la Villa de Madrigal, de la Orden de San Agustín. La joven es embaucada por Gabriel Espinosa, un hombre que gracias a su notable parecido físico, se hacía pasar por el rey Don Sebastián I de Portugal, desaparecido en la batalla de Alcazarquivir. Éste corteja a Doña María Ana con la ayuda de su confesor Fray Miguel de los Santos, y ésta deslumbrada por la esperanza de convertirse en reina de Portugal les ayuda. Finalmente, Espinosa es detenido en posesión de unas joyas entregadas por Doña María Ana, que de esta forma se ve involucrada en la conspiración.
Desarticulada la trama, Espinosa es condenado en 1595, ahorcado, decapitado y descuartizado, y sus restos expuestos en las entradas de la villa de Madrigal, y Fray Miguel es ahorcado en la Plaza Mayor de Madrid. En el caso de la joven, no le espera un final mejor, pues es desposeída de sus privilegios y recluida en estricta clausura en el Convento de Nuestra Señora de Gracia de Ávila. Allí pasó poco más de 3 años, hasta que su primo Felipe III, a poco de suceder a su padre, la hizo devolver al monasterio de Madrigal, donde, restituida su influencia fue elegida priora.
Años después, fue perdonada por su primo Felipe III, y en 1611, dejando la orden de San Agustín, fue nombrada abadesa perpetua del cisterciense Monasterio de Santa María la Real de Las Huelgas, la mayor dignidad eclesiástica a que una mujer podía aspirar. Falleció en el monasterio burgalés a finales de 1629.