La múltiple herencia de Carlos V agravará unas relaciones que distaban de ser buenas. Además de en el Sur, Francia pasará a lindar con los Habsburgo en los Países Bajos y el Franco Condado, de tal forma que se sentirá prácticamente cercada. En esta situación, el control sobre Milán era esencial para ambas potencias, pues resultaba necesario como nexo de unión de los territorios del emperador, razón suficiente para que los reyes franceses intentasen ocuparlo. A todo ello hay que añadir las pretensiones de Carlos V de recuperar todos los territorios que habían pertenecido a la Casa de Borgoña y que estaban bajo soberanía francesa, y de Francisco I de hacer lo propio con el Rosellón y la Navarra española. De este modo, el escenario de los ¡enfrenamientos se ampliará desde Italia a otros múltiples frentes, que van de Navarra a Borgoña y de la Provenza al País Vasco, llegando hasta Roma, donde cada nueva elección papal supondrá presiones en pro de un Pontífice filofrancés o filoespañol. Estas guerras casi endémicas continuarán a lo largo de siglo y medio y sólo cesarán cuando la decadencia española permita volverse a Francia hacia otros frentes.
La rivalidad entre Carlos V y Francisco I se había iniciado con la candidatura de ambos a la elección imperial de 1519. La guerra abierta la inició poco después el rey francés, aprovechando el momento de debilidad que suponían la Comunidades y las Germanías, la ruptura de Lutero ya en marcha y el imparable avance truco, que no sólo afectaba al Mediterráneo sino a las fronteras sudorientales d los territorios patrimoniales de los Habsburgo. Se comprende, así, que el emperador hiciese todo lo posible por llegar a un acuerdo pacífico con los luteranos, lo que incrementó aún más los recelos papales.
En la declaración de nuevas hostilidades, Francisco I apoyó, en 1521, al rey de Navarra en su pretensión de recuperar la mitad subpirenaica, de donde fue desalojado el mismo año por el emperador. La victoria imperial se repitió, casi simultáneamente, en Milán. El respaldo que prestaba a Carlos V el nuevo Papa, su antiguo preceptor Adrian VI, Enrique VIII de Inglaterra, por el Tratado de Windsor de 1522, fue decisivo para el resultado final de las campañas llevadas a cabo en varios frentes, que terminaron en 1525 con la captura en el sitio de Pavía del rey francés, trasladado a España. Pareció entonces que el emperador estaba en la situación más favorable para conseguir una paz duradera, el Tratado de Madrid de 1526, al poder imponer sus condiciones –la devolución de la Borgoña y el desalojo del Milanesado− a cambio de una amistad firmada con el matrimonio de Francisco con su hermana mayor, la infanta Leonor.
A pesar de haber dejado en rehén a sus dos hijos, Francisco I incumplió inmediatamente los acuerdos, puesto que meses después firmó la Liga de Cognac con Enrique VIII, que ya había iniciado el proceso de divorcio de Catalina de Aragón, el papa Clemente VII, Venecia, Florencia y hasta Franciso Sforza, restaurado en el ducado de Milán, todos ellos alarmados por el excesivo poder imperial. La situación se volvió difícil para Carlos, que ese mismo año vio cómo los turcos ocupaban la mayor parte de Hungría tras la batalla de Mohács, en la que murió su cuñado Luis II Jagellón, amenazando a la misma Austria. Estas dificultades le obligaron a acceder a las demandas de los príncipes protestantes, planteadas en la Dieta de Spira de 1526.
Aunque necesitaba urgentemente la paz en el frente italiano, Carlos V pudo defenderse en una campaña victoriosa en la que, aun contando con el desafortunado incidente del Saco de Roma (1527) por las tropas imperiales, consiguió imponerse con la ayuda del almirante genovés Andrea Doria. En la llamada paz de Cambrai o de las Damas (1529), negociada por la tía del emperador, Margarita de Austria, y Luisa de Saboya, madre de Francisco I, éste reconoció el dominio del emperador sobre Flandes y Artois, aunque no de Borgoña, y renunció a sus derechos sobre Nápoles y Milán, al tiempo que se decidía la devolución de los dos príncipes franceses rehenes a cambio del pago de un alto rescate.
La coronación de Carlos como emperador en Bolonia, en febrero de 1530, confirmó su hegemonía en Italia, donde pudo imponer a los príncipes que le parecieron convenientes: repuso a los Sforza una vez más en Milán, casando al duque Francisco con su sobrina Cristina de Dinamarca, y devolvió Florencia a los Médicis, a cuya familia pertenecía el Pontífice. Consiguió, además, una alianza con los Estado italianos, incluida Venecia, que, pese a los recelos que le causaban los deseos austríacos de salir al Adriático, necesariamente por territorio de la Serenísima, precisaba ayuda frente a los turcos.
Pero suponer que los conflictos iban a terminar era gran ingenuidad, conociendo las dificultades de Carlos con protestantes y turcos, que en 1529 llegaron a las puertas de Viena. En 1530 asistió a la Dieta de Augsburgo, donde su fórmula para llega a un acuerdo común reuniendo un concilio general fue rechazada tanto por el Papa como por los protestantes, que en 1531 formaron la Liga de Esmalcalda. El en mismo año, el emperador nombró a su hermana María de Austria gobernadora en los Países Bajos, donde la expansión del luteranismo y del particularismo político y fiscal y el crecimiento del descontento de los sectores populares adscritos al anabaptismo obligarán a una continua atención desde los años treinta.
En esta coyuntura, la muerte sin sucesión en 1535 del duque de Milán, Francisco Sforza, fue el detonante del nuevo conflicto, puesto que legalmente el ducado revertía a Carlos V. Francisco I, que había tendido una amplia red diplomática en Italia, incluida la boda de Catalina de Médicis con su hijo Enrique, intentó evitarlo y ocupó Saboya (1536), ante lo cual el emperador, indignado por los acuerdos franco-turcos, invadió personalmente la Povenza. Aunque la campaña francesa terminó con un gran fracaso para Carlos, en Italia pudo resistir, con la ayuda de sus aliados, Venecia y los Estados pontificios. El Tratado de Niza (1538) procuró unos años de paz a esta zona de Europa, manteniendo el statu quo en Italia y entregando Saboya y el Piamonte a Francia.